果树苗木无毒苗的培育

果树苗木无毒苗的培育
果树苗木病毒病多由嫁接传染，一旦病毒侵入树体后，在自 然条件下永远保存在树体中，无法消除。根据果树苗木病毒病及 其类病毒病害的侵染、传播和发病特点，国内外总的防治策 略是使用无病毒或抗病毒繁殖材料，严格植物检疫，清除和 限制侵染源，防治和控制传毒虫媒。果树苗木嫁接繁殖时，如果 母本树带有病毒，就必然把病毒传染给新繁殖的苗木。目 前，在栽培的果树苗木中，有些品种已全部受病毒侵染，患有病 毒病。为了避免病毒病的危害，就必须清除病树中的病毒， 使之无病毒化，这是果树苗木病毒病防治对策的第一步。

获得无病毒母本树的方法主要有3种。第一种方法是从 果园中选择品种纯正、多年间树势健壮、品质产量都好的单 株，经病毒检验，确认无病毒后即可获得母本树；第二种方 法是人工培育无病毒母本树，包括通常采用热处理与茎尖培 养相结合和茎尖生长点培养2种方法；第三种方法是引进国 外无病毒品种。

果树苗木热处理脱毒，是生产上应用最早、最广泛的一种脱 毒手段。在果树苗木生产上，这种技术已经很成熟，已培育出许 多无病毒果树苗木单株。而茎尖组织培养需要精细的技术，与热 处理相比，难度大得多。但是对于用热处理不能或难于清除 的病毒，用茎尖培养或热处理同组织培养相结合的方法，则 可以获得无病毒的个体。此外，最近开发出的微体嫁接技 术，已应用于获得无病毒个体并引起了人们的广泛关注，其主要原理是在无菌条件下培养的砧木实生苗上，嫁接茎尖分 生组织，进而获得无病毒苗。

一、热处理脱毒

早在100多年前，苏格兰的园艺工作者就开始利用热力 治疗植物病害。1923年，采用温汤处理而脱去甘蔗的一种 病毒，成为了在病毒病害中最早脱毒成功的例子。在果树苗木方 面，于1936〜1941年间，对桃丛生病、桃黄化病、伪桃病 等，先后用热处理，主要是温汤浸渍法获得脱毒成功。其中 对桃丛生病毒，不仅用温汤而且用高温空气处理也获得成 功。同时设计出一种处理装置，探索出了热空气处理法。即 把空气温度调节在30~40^0之间，处理一定时间，以达到 脱毒的目的。自1950年对马铃薯卷叶病毒用热处理脱毒取 得成功以来，到目前为止，除黄化型病毒以外，其他多种病 毒的脱毒也相继取得成功。常绿果树苗木病毒病用热处理法脱毒 并取得成功的实例主要有柑橘速衰病毒、柑橘裂皮类病毒、 柑橘脉突病毒、柑橘碎叶病毒等。

热处理方法有2种，一是温汤浸渍和高温蒸汽处理，另 一是高温空气处理。

(一）温汤浸溃和高温蒸汽处理

通常应用的有50〜551处理10~501!^、5^：处理1〜5}1 或35cC处理30〜40h等多种温时组合。特别是热不稳定的 病毒类，有些病例在40〜45^：处理5〜301丨11或30^：处理34 即可脱毒。即树体的一部分。由于温汤处理对植物体的损害 较大，有时会导致植物组织窒息或是呈水渍状，所以在对果 树进行热处理时，通常只处理接穗；而高温蒸汽处理，则对 -42 – 植物组织损害较少，因此，现在多用高温蒸汽处理。在进行 热处理时，最重要的是要严格控制温度和处理时间。

(二）高温空气处理

处理的植物体，通常多用盆栽被病毒侵染的整株苗木， 因为热处理所用的病株，其染病组织越小脱毒效果越高。但 刚移栽的苗木根系耐热性差，一般用移栽后3个月，最好用 盆栽1年左右的苗木进行处理。泥制花盆具有良好的耐热 性，热处理中根部温度将比热处理温度下降数度，因此推荐 用泥制花盆。所以柑橘、苹果的热处理，用无病毒的实生砧 芽接带毒的病穗，芽接1周后开始进行热处理，脱毒效果良 好。目前，热处理装置有多种，小的只有11^，大的人可以 进入内部操作，可供大量试材热处理用。为调节湿度，还应 安装加湿器。尽管高温空气处理不像温汤处理那样，要求病 毒钝化温度与植物体能忍受温度之间相吻合，但温度及有关 条件也必须力求精密。

热处理温度因病毒种类而异。有的病毒在33〜34尤条 件下即可脱毒，另一些病毒必须在39〜42的条件下，才 能脱毒。生产实践中，一般多用35〜381恒温，尤以381 恒温的实例较多。如苹果在37尤土1尤恒温下热处理28〜 30d,对褪绿叶斑病毒、茎痘病毒和茎沟病毒的平均脱毒率 为 26. 5%。

许多病例证明，变温热处理较恒温热处理的脱毒效果 好。近年来，为了减少高温对植物体的损伤，有些病例改为 白天用40〜45^：处理12〜16h,夜间30〜35^：处理8 ~ 12ho

生产实践中以白天如^处理^匕，夜间30(^处理8匕的实例 居多。但也不能一概而论。如柑橘速衰病毒幼苗黄化株系， 在381恒温条件下处理8周不能脱毒，必须处理12周才能 脱毒；反之，在白天40，夜间30(^的变温条件下，处理 8周即能脱毒。柑橘碎叶病毒，38^处理16周不能脱毒， 但白天401、夜间301处理6周和白天441、夜间301处 理2周却脱毒成功。

在进行热处理脱毒时，还应控制好相对湿度和光照。通 常相对湿度应保持在70^〜80*之间。在过分干燥的条件 下，热处理的新梢生长不良。光以自然光最好，但秋冬期 间，适当补充人工光照，对新梢伸长有良好作用。而有的病 例用荧光灯和白色灯照明161即可脱毒。

为了提高植物的耐热性，延长植物在热处理中的生存时 间，热处理前往往要进行预处理。例如，在用38^：热处理 前，先在27〜351下处理1〜2周。在植物耐热性允许的范 围内，热处理的温度越高脱毒效果越好，因此，前处理的温 度也以逐渐由低到高为好。

植物体的耐热性与植物体各部分组织中的碳水化合物的 含量成正相关，因此，应在植物组织成熟的季节进行 热处理。

用热处理脱毒法培育无病毒个体时，通常是剪取苗木在 热处理中伸长出的新梢顶端嫩枝，将其嫁接到无病毒实生砧 木上。若是用新梢停止生长的苗进行热处理时，可剪取已硬 化的枝条，直接嫁接到砧木上。对于葡萄，剪取热处理中伸 长新梢或副梢的顶端部分，长约1〜5。1，扦插在珍珠岩等 适宜的保湿扦插床中，不久即发根，一个月后即可移植。如 果用此法不能获得无病毒个体时，就必须剪取新梢顶端更短的部分。

二、茎尖培养脱毒

(―)概述

病毒侵入植物体后，一般具有系统侵染性，也即具有全 身扩展的特性，但不同的组织和部位，病毒的分布和浓度有 很大差异，甚至有的组织或部位尚无病毒。植物感染病毒后 不含有病毒的部位，对病毒的防治具有重要的意义。例如， 大多数植物的种子不带病毒，因此可以自然获得无病毒后 代。除种子之外生长点附近，即茎尖和根尖的分生组织也多 不含有病毒。但不含有病毒的部分是极小的，不超过0. 1〜

0.5mn^这样小的无病毒组织，以往无法繁殖利用。自组织 培养技术发展以来，可以切取这种微小的无病毒组织，用组 织培养技术也可培养成完整的植株。如1934年White用感 染烟草花叶病毒的番茄根和1949年Limasset等用感染烟草 花叶病毒的烟草茎分别进行的研究结果表明，病毒浓度呈梯 度变化，病毒粒子随着植物组织的成熟而增加，顶端组织不 带病毒。Morel等于1952年从感染花叶病毒和斑萎病毒的植 株上，切取茎尖组织进行培养，成功地获得无病毒的大丽 花。目前，茎尖培养在草本植物上应用较多，而在木本植物 上应用甚少。这项技术在番木瓜、草莓、柑橘和葡萄的脱毒 方面，已获成功并取得初步应用效果。

茎尖培养脱毒程序，一般有以下6个步骤：第一步，材 料处理和接种；第二步，诱导芽分化和小植株的增殖；第三 步，诱导生根；第四步，生根植株的移栽；第五步，移入苗 :第六步，病毒检测。其中分化、增殖、生根3个步骤，

均需要特殊的培养基。在果树苗木茎尖培养中最常使用的是河-

培养基，但各步骤中所需要的植物生长调节剂种类、用量及 配合比例各不相同，并依培养的果树苗木种类而异。脱毒成功机 率与茎尖大小直接相关。对不同的植物，采用大小相同的茎 尖进行培养，脱毒效果主要取决于病毒类型而不是植物种 类。正常茎尖培养时切取的茎尖越小，脱毒率就越高。草莓 切取茎尖为0.2〜0.311^时，脱毒率为100*;切取茎尖为 1.011^时，脱毒率仅为50*。但茎尖过小培养成活率低， 而且操作难度也大。因此，脱毒时要兼顾脱毒率和成活率， 茎尖切取的大小要适中，一般切取长度为0.2~0.50^，带 有1〜2个叶原基的茎尖作为培养材料。苹果切取0. 1〜

0.211^茎尖培养，脱毒株率为35.0^。其中，苹果褪绿叶 斑病毒的脱毒株率为80.0^，苹果茎痘病毒的为65.0^, 苹果茎沟病毒的为50.0^。在未脱除的病毒中，苹果褪绿 叶斑病毒占19.19^，苹果茎痘病毒占33.3*，苹果茎沟病 毒占47. 6%。

(二）茎尖培养脱毒机制

应用电子显微镜和荧光抗体技术可以明显地看出，在每 一个“植物-病毒”组合中，都存在一*个特殊的顶端免疫 区。这个顶端免疫区决定了无毒茎尖的大小^如果仅最顶端 一个细胞不带病毒，则无毒签尖大小为0.1〜0.3^^;如果 免疫区比较大，则无毒莲尖大小为0.5〜3111^然而，即使 在分生组织细胞中有病毒粒子，培育无病毒苗也是可能的。 对此已提出多种解释，如：正常的或病毒的核蛋白合成之间 的营养竞争、酚胺抑制剂的存在和因切取茎尖时细胞受伤而 引起的代谢破坏。虽然这些假设中没有一种令人十分信服的 解释，然而，这些假设却很好地说明了较小的茎尖对于脱毒是最重要的。

(三）应用

茎尖培养获得的小幼株，可离体培养得到分生单系。要 尽可能快地对每一个分生单系的2株或3株小幼株进行鉴 定，确定是否还带病毒。在确定分生单系是否不带病毒之 前，需多次重复这些实验。在有条件的单位，可用酶联免疫 吸附检测法代替指示植物进行这种鉴定。由此而获得的无病 毒分生单系，通过腋生分枝快速繁殖，可在短期内给生产单 位提供无病毒试管苗。

通常情况下，无病毒苗是保存在黑暗、低温的条件下， 在此条件下，无病毒苗可在试管中保存很长时间。如木本果 树的试验结果是，切除在繁殖培养基上伸长生长茎的所有叶 片，再把茎浸渍在基本培养基中，然后把试管放在冰箱中， 结果5年后，这些枝条在新鲜培养基上仍能增殖。

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二、茎尖培养脱毒

(―)概述

病毒侵入植物体后，一般具有系统侵染性，也即具有全 身扩展的特性，但不同的组织和部位，病毒的分布和浓度有 很大差异，甚至有的组织或部位尚无病毒。植物感染病毒后 不含有病毒的部位，对病毒的防治具有重要的意义。例如， 大多数植物的种子不带病毒，因此可以自然获得无病毒后 代。除种子之外生长点附近，即茎尖和根尖的分生组织也多 不含有病毒。但不含有病毒的部分是极小的，不超过0. 1〜

0.5mn^这样小的无病毒组织，以往无法繁殖利用。自组织 培养技术发展以来，可以切取这种微小的无病毒组织，用组 织培养技术也可培养成完整的植株。如1934年White用感 染烟草花叶病毒的番茄根和1949年Limasset等用感染烟草 花叶病毒的烟草茎分别进行的研究结果表明，病毒浓度呈梯 度变化，病毒粒子随着植物组织的成熟而增加，顶端组织不 带病毒。Morel等于1952年从感染花叶病毒和斑萎病毒的植 株上，切取茎尖组织进行培养，成功地获得无病毒的大丽 花。目前，茎尖培养在草本植物上应用较多，而在木本植物 上应用甚少。这项技术在番木瓜、草莓、柑橘和葡萄的脱毒 方面，已获成功并取得初步应用效果。

茎尖培养脱毒程序，一般有以下6个步骤：第一步，材 料处理和接种；第二步，诱导芽分化和小植株的增殖；第三 步，诱导生根；第四步，生根植株的移栽；第五步，移入苗 :第六步，病毒检测。其中分化、增殖、生根3个步骤，

均需要特殊的培养基。在果树苗木茎尖培养中最常使用的是河-

培养基，但各步骤中所需要的植物生长调节剂种类、用量及 配合比例各不相同，并依培养的果树苗木种类而异。脱毒成功机 率与茎尖大小直接相关。对不同的植物，采用大小相同的茎 尖进行培养，脱毒效果主要取决于病毒类型而不是植物种 类。正常茎尖培养时切取的茎尖越小，脱毒率就越高。草莓 切取茎尖为0.2〜0.311^时，脱毒率为100*;切取茎尖为 1.011^时，脱毒率仅为50*。但茎尖过小培养成活率低， 而且操作难度也大。因此，脱毒时要兼顾脱毒率和成活率， 茎尖切取的大小要适中，一般切取长度为0.2~0.50^，带 有1〜2个叶原基的茎尖作为培养材料。苹果切取0. 1〜

0.211^茎尖培养，脱毒株率为35.0^。其中，苹果褪绿叶 斑病毒的脱毒株率为80.0^，苹果茎痘病毒的为65.0^, 苹果茎沟病毒的为50.0^。在未脱除的病毒中，苹果褪绿 叶斑病毒占19.19^，苹果茎痘病毒占33.3*，苹果茎沟病 毒占47. 6%。

(二）茎尖培养脱毒机制

应用电子显微镜和荧光抗体技术可以明显地看出，在每 一个“植物-病毒”组合中，都存在一*个特殊的顶端免疫 区。这个顶端免疫区决定了无毒茎尖的大小^如果仅最顶端 一个细胞不带病毒，则无毒签尖大小为0.1〜0.3^^;如果 免疫区比较大，则无毒莲尖大小为0.5〜3111^然而，即使 在分生组织细胞中有病毒粒子，培育无病毒苗也是可能的。 对此已提出多种解释，如：正常的或病毒的核蛋白合成之间 的营养竞争、酚胺抑制剂的存在和因切取茎尖时细胞受伤而 引起的代谢破坏。虽然这些假设中没有一种令人十分信服的 解释，然而，这些假设却很好地说明了较小的茎尖对于脱毒是最重要的。

(三）应用

茎尖培养获得的小幼株，可离体培养得到分生单系。要 尽可能快地对每一个分生单系的2株或3株小幼株进行鉴 定，确定是否还带病毒。在确定分生单系是否不带病毒之 前，需多次重复这些实验。在有条件的单位，可用酶联免疫 吸附检测法代替指示植物进行这种鉴定。由此而获得的无病 毒分生单系，通过腋生分枝快速繁殖，可在短期内给生产单 位提供无病毒试管苗。

通常情况下，无病毒苗是保存在黑暗、低温的条件下， 在此条件下，无病毒苗可在试管中保存很长时间。如木本果 树的试验结果是，切除在繁殖培养基上伸长生长茎的所有叶 片，再把茎浸渍在基本培养基中，然后把试管放在冰箱中， 结果5年后，这些枝条在新鲜培养基上仍能增殖。